Laborationer utförs i fyra dagar och första dagen av laborationen utfördes den 7 september 2011.
Första dagens laborations uppgifter är:
Att rena en rekombinat plasmid från en bakteriesuspension och att ta reda på renhet av plasmid DNA samt koncentration av DNA.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Troligtvis har föroreningar så som kromosomalt DNA, proteiner samt celldebris(cellrest) tagits bort från suspension.
Att ta reda på renhet av plasmid användes spektrometern genom aborbansmätning. Vid 260nm har nukleotider sitt absorbansmaxium och vid 280nm har proteiner sitt absorbansmaxium. Genom att beräkna kvot mellan absorbansvärdena (260nm/280nm =kvot) kan man veta renhet av plasmid. Kvot mindre än 1.8 är tecken på protein i plasmid.
Försök I:
Absorbans vid 260nm blev 0.044 och asorbans vid 280nm blev 0.013. Detta ger kvot ca 3.4 vilket är för högt. Koncentration av detta försök blev 16.9. Koncentration av DNA i plasmidlösningen kan räknas vid en absobans på 1.0 vid 260nm detta motsvarar 50μg DNA/ml.
Koncentration beräkning:
3.38 • 50μg/ml(=0,005μg/μl)=0.169
0.169•100(spädning) = 16.9 μg/μl
Absorbans vid 260nm blev 0.044 och asorbans vid 280nm blev 0.013. Detta ger kvot ca 3.4 vilket är för högt. Koncentration av detta försök blev 16.9. Koncentration av DNA i plasmidlösningen kan räknas vid en absobans på 1.0 vid 260nm detta motsvarar 50μg DNA/ml.
Koncentration beräkning:
3.38 • 50μg/ml(=0,005μg/μl)=0.169
0.169•100(spädning) = 16.9 μg/μl
Eftersom vi fick för högt resultat gjordes ett andra försök för att se om det påverkades av blank.
Försök II:
Blank: 10μl EB buffert tillsätts blanken (10μl EB +990μl TE). Då absorbans vid 260nm blev 0. 068 och vid 280nm blev 0.037 vilket ger en kvot ca.1.84. koncentrationen beräknades 0.34μg/μl. (0.068•0.05μg/μl= 0.0034μg/μl → 0.0034μg/μl •100(spädning)= 0.34μg/μL
Det är ett bra resultat eftersom ren plasmid skulle vara mellan 1.8–2.0. Vilket tyder på att kontamination av proteiner inte finns.Men vi vet inte om det finns rester av DNA och RNA eftersom de också har absoptionsmaxium vid 260nm.
Blank: 10μl EB buffert tillsätts blanken (10μl EB +990μl TE). Då absorbans vid 260nm blev 0. 068 och vid 280nm blev 0.037 vilket ger en kvot ca.1.84. koncentrationen beräknades 0.34μg/μl. (0.068•0.05μg/μl= 0.0034μg/μl → 0.0034μg/μl •100(spädning)= 0.34μg/μL
Det är ett bra resultat eftersom ren plasmid skulle vara mellan 1.8–2.0. Vilket tyder på att kontamination av proteiner inte finns.Men vi vet inte om det finns rester av DNA och RNA eftersom de också har absoptionsmaxium vid 260nm.
Hej!
SvaraRaderaSyftet med bloggen är att svara på de 3 frågorna. Den första frågan har du besvarat bra. Näst följande fråga angående resultatet och om man fick ren plasmid har du också besvarat. Dock blir det lite rörigt att läsa när du skriver ihop allt. Du skulle kunnat dela upp det bättre. BRA att ni gjorde ett till försök! Sedan ska du kommentera resultatet. Du sa att det blev bra. Men jag saknar lite diskussion kring ditt diagram. Du kunde kanske visat hur den såg ut?
Om du skulle fått en absorbans som var lägre än 260nm eller högre än 280nm? Vad kunde det bero på då?
Fortsätt kämpa på! :) / Carolina Larsen
Hej Mihee,
SvaraRaderabra att du skriver att ni inte kan veta om det finns rester av kromosomalt DNA och RnA kvar! Det ska vi ta reda på imorgon.
Märit
Bra att du tog med båda försöken i din beskrivning av resultatet. Fick ni nån förklaring till varför det blev sån stor skillnad på resultaten i de båda försöken? Skulle vilja ha lite mer diskusion av resultatet och gärna en bild på spektrofotometrin, men du kanske precis som jag inte tog någon bild?
SvaraRadera//Sophie
Det är bra att du tog upp på slutet att man med den här absorbanskvoten inte kan avgöra om det finns föroreningar av något annat än protein, för det framgick inte ordentligt när du först beskrev kvotens innebörd.
SvaraRaderaVad bra att ni kunde göra om försöket! Försök II verkar ju bra! :)