Dag 2
Idag har du utfört en PCR.
Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?
Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?
Resultat av vår PCR- reaktion blev inte bra trots att det tillsattes en känd LL37- gen. Den första brunnen på positiva kontrollen visade ingen amplifiering. Det bör alltså ske en amplifiering om PCR-reaktion har fungerat som det skulle, eftersom primrar som är specifika för LL37 skulle binda till genen(LL37) och därmed fås amplifiering.
Kunde detta resultat bero på fel pipettering av Taq-polymeras, att mängden av enzymet minskades i master mix så att tamplatsträngarn inte ampliferades. Det kunde också vara att enzymet inte bladades väl med master mix.
På andra brunnen (negativa kontrollen) bör inte amplifiering ske eftersom det inte tillsatts något templat DNA(plasmid) varvid primrarna inte kunde binda till plasmid. Men vårt resultat i den negativa kontrollen visade ett mycket svagt band (tyvärr det syns inte på bilden som jag har fotat) som skulle vara LL37-gen 550bp, jämfört med markören VI som är i tredje brunnen. Detta resultat tyder på att vi har fått carry over kontamination. Denna kontamination kan antagligen bero på att vi missade använda filterspetsar då vi pipetterade PCR proverna i Master Mix. Troligen LL37-gen följde med pipetten från det positiva provet till pipettspetsen som användes för i den negativa kontrollen.
I fjärde brunnen har vi provet plasmid DNA och det ser ut som att primer har bundit ospecifika molekyler. Dessutom ser det ut som att markören III som finns i femte brunnen rann över till provet. Jag vet inte om provet har påverkats av den.
I fjärde brunnen har vi provet plasmid DNA och det ser ut som att primer har bundit ospecifika molekyler. Dessutom ser det ut som att markören III som finns i femte brunnen rann över till provet. Jag vet inte om provet har påverkats av den.
Vi skulle också fullfölja första dagens laboration med att kontrollera renheten av plasmid.
Vi kontrollerade plasmids renhet från kromsomat DNA eller RNA m. h. a. elektrofores. I sjätte brunnen tillsattes plasmid preparation och det syns tydligt ett band som visar plasmiden. Men den kan inte jämföras med markören som är linjära baspar med ccc-formad plasmid, eftersom linjära molekyler DNA vandrar långsammare än cirkulära supercoild plasmider.
Vi lyckades rena plasmiden från DNA/RNA molekyler. Om det skulle finnas förorening av kromosomalt DNA skulle DNA molekyler visas strax under brunnen VI och RNA molekyler nedanför plasmiden som smer men det visades ingen av dem.
Däremot eventuella open circle och linjär plasmid visas ovanför plasmid. De är samma plasmid som fick en nick brott(open circle) eller dubbel nick brott(linjär) i en fosfodiesterbindning.
Vi kontrollerade plasmids renhet från kromsomat DNA eller RNA m. h. a. elektrofores. I sjätte brunnen tillsattes plasmid preparation och det syns tydligt ett band som visar plasmiden. Men den kan inte jämföras med markören som är linjära baspar med ccc-formad plasmid, eftersom linjära molekyler DNA vandrar långsammare än cirkulära supercoild plasmider.
Vi lyckades rena plasmiden från DNA/RNA molekyler. Om det skulle finnas förorening av kromosomalt DNA skulle DNA molekyler visas strax under brunnen VI och RNA molekyler nedanför plasmiden som smer men det visades ingen av dem.
Däremot eventuella open circle och linjär plasmid visas ovanför plasmid. De är samma plasmid som fick en nick brott(open circle) eller dubbel nick brott(linjär) i en fosfodiesterbindning.
Hej Mihee
SvaraRaderaBra att ni kunde se att plasmiden inte innehöll kromosomalt DNA eller RNA.
Det som var bra med ert resultat vid PCR är att då fick ni praktiskt lära er att när man får ett negativt resultat dvs ingen PCR-produkt för provet, så behöver man den positiva kontrollen för att se om det är ett sant negativt resultat. Med hjälp av den kunde ni se att PCR-reaktionen inte har fungerat. Det är troligen något fel på Mastermixen, och då kan ni ju inte få någon amplifiering i provet heller. Du har en rimlig förklaring till vad som kan ha orsakat felet.
Den negativa kontrollen är helt ointressant i detta fall. Den har man för att se om en amplifiering i provet fanns i provet från början eller har hamnat där av misstag genom carryoverkontamination. Om ni inte ens har amplifiering i provet, behöver ni inte titta på negativa kontrollen.
Märit
bra försökt med förklara vad du trodde som gick fel, jag skulle personligen tycka så oxå om det hände oss. Men märit gav en annan perspektivt som jag aldrig heller tänkte p..
SvaraRadera