söndag 2 oktober 2011

Laboration dag 4

Dag 4
Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

                                             Elektrofores

I första brunnen är oklyvd plasmid som är i olika former. Det översta bandet syns mycket svagt, är open circle och/eller linjär plasmid och nedanför denna är supercoild plasmid.
I andra och fjärde brunnen visas respektive markör III och VI.
I tredjebrunnen visas klyvd plasmid(0,5
μg) och översta bandet är vektor utan insert och nedan för denna är vektor med insert(LL37-gen).
Klyvd plasmid (0,005
μg) som var i femte brunnen visas inte. Det kan bero på att det var för lite mängd därmed kunde det inte detekteras av elektrofores.
                                                    Southern blot
Med Southern blotting ser man flera band av oklyvd plasmid (rekombinant plasmid) som är i olika former (linjär nick circle, och supercoild), vilka inte syntes med elektrofores. Med stringenstvätt lyckades vi tvätta bort prober som har bundit till ospecifika markörer därmed syns de inte i membranet.
Med klyvd plasmid(0.5
μg) syns två tydliga band, översta bandet är oklyvd plasmid eller prober som har bundit till templat(vektor). Det är troligt att restiktionsenzym har bundit till andra restriktionssite i plasmiden som är ganska lik med LL37-gen. Nedanför denna finns ett starkt band som visar klyvd plasmid LL37-gen.
Med plasmidlösningen (0,005
μg) syns inte något band. Detta kan bero på att hybridiseringslösning hade läckt ur falconrör under natten vid inkubation. Därmed fanns för lite probe i röret för att kunna detekteras.
Med Southern blot kan man detektera en liten koncentration även om det sökta fragmentet har en annan form. Nackdelen är att man måste utföra många moment varvid olika faktorer kan påverka resultatet(detektion) dessutom tar det längre tid än PCR.
PCR är en lättare metod och mindre tidskrävande att utföra än Southern blot men den har stor risk för carry over kontamination (t.ex. vårt PCR resultat). PCR är en känslig metod varvid fås PCR-amplikat av små mängder.
Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 
Bra med laborationen var att jag fick lära mig mera säkrare pipettering. Under laborationen insåg jag att hur det var viktigt att planera och lägga upp arbetet. Att man ska vara noggrann för att undvika t.ex. kontamination som vi fick under laborationen.

2 kommentarer:

  1. Hej Mihee!
    Du har en bra diskussion mellan de olika metoderna. Ja, vi alla kan nog stämma in på att man blivit säkrare på pipetteringen.
    Intressant att läsa att det inte blev något synligt band på 0,005 μg spädningen. För vårat rör var också nästintill torrt när jag plockade ur det på morgonen men vi fick ett synligt band. Kanske det inverkar hur länge det varit torrt i röret? Bra med en diskusion runt varför det inte blev detektion på det bandet.

    Bra jobbat! //Sophie

    SvaraRadera
  2. Hej Mihee,
    du tar upp att med Southern kan man "detektera.....
    även om det sökta fragmentet har en annan form."
    Det stämmer att med Southern kan vi se LL 37 både i oklyvd plasmid och separat i insert efter klyvning, medan med PCR ser man bara att LL 37 finns i provet, men inte vad det ev är bundet till. Det kan ju vara relevant i något fall, men om syftet bara är att påvisa att LL37 finns i provet, så väljer nog alla att utföra PCR i st f Southern.
    Roligt att läsa vad du har lärt dig, hoppas du har nytta av detta i fortsättningen!
    Märit

    SvaraRadera