Laboration dag 4

Dag 4

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

                                             Elektrofores

I första brunnen är oklyvd plasmid som är i olika former. Det översta bandet syns mycket svagt, är open circle och/eller linjär plasmid och nedanför denna är supercoild plasmid.
I andra och fjärde brunnen visas respektive markör III och VI.
I tredjebrunnen visas klyvd plasmid(0,5μg) och översta bandet är vektor utan insert och nedan för denna är vektor med insert(LL37-gen).
Klyvd plasmid (0,005μg) som var i femte brunnen visas inte. Det kan bero på att det var för lite mängd därmed kunde det inte detekteras av elektrofores.

                                                    Southern blot

Med Southern blotting ser man flera band av oklyvd plasmid (rekombinant plasmid) som är i olika former (linjär nick circle, och supercoild), vilka inte syntes med elektrofores. Med stringenstvätt lyckades vi tvätta bort prober som har bundit till ospecifika markörer därmed syns de inte i membranet.
Med klyvd plasmid(0.5μg) syns två tydliga band, översta bandet är oklyvd plasmid eller prober som har bundit till templat(vektor). Det är troligt att restiktionsenzym har bundit till andra restriktionssite i plasmiden som är ganska lik med LL37-gen. Nedanför denna finns ett starkt band som visar klyvd plasmid LL37-gen.
Med plasmidlösningen (0,005μg) syns inte något band. Detta kan bero på att hybridiseringslösning hade läckt ur falconrör under natten vid inkubation. Därmed fanns för lite probe i röret för att kunna detekteras.

Med Southern blot kan man detektera en liten koncentration även om det sökta fragmentet har en annan form. Nackdelen är att man måste utföra många moment varvid olika faktorer kan påverka resultatet(detektion) dessutom tar det längre tid än PCR.

PCR är en lättare metod och mindre tidskrävande att utföra än Southern blot men den har stor risk för carry over kontamination (t.ex. vårt PCR resultat). PCR är en känslig metod varvid fås PCR-amplikat av små mängder.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 

Bra med laborationen var att jag fick lära mig mera säkrare pipettering. Under laborationen insåg jag att hur det var viktigt att planera och lägga upp arbetet. Att man ska vara noggrann för att undvika t.ex. kontamination som vi fick under laborationen.

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.

Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Resultat av vår PCR- reaktion blev inte bra trots att det tillsattes en känd LL37- gen. Den första brunnen på positiva kontrollen visade ingen amplifiering. Det bör alltså ske en amplifiering om PCR-reaktion har fungerat som det skulle, eftersom primrar som är specifika för LL37 skulle binda till genen(LL37) och därmed fås amplifiering.

Kunde detta resultat bero på fel pipettering av Taq-polymeras, att mängden av enzymet minskades i master mix så att tamplatsträngarn inte ampliferades. Det kunde också vara att enzymet inte bladades väl med master mix.

På andra brunnen (negativa kontrollen) bör inte amplifiering ske eftersom det inte tillsatts något templat DNA(plasmid) varvid primrarna inte kunde binda till plasmid. Men vårt resultat i den negativa kontrollen visade ett mycket svagt band (tyvärr det syns inte på bilden som jag har fotat) som skulle vara LL37-gen 550bp, jämfört med markören VI som är i tredje brunnen. Detta resultat tyder på att vi har fått carry over kontamination. Denna kontamination kan antagligen bero på att vi missade använda filterspetsar då vi pipetterade PCR proverna i Master Mix. Troligen LL37-gen följde med pipetten från det positiva provet till pipettspetsen som användes för i den negativa kontrollen.
I fjärde brunnen har vi provet plasmid DNA och det ser ut som att primer har bundit ospecifika molekyler.  Dessutom ser det ut som att markören III som finns i femte brunnen rann över till provet. Jag vet inte om provet har påverkats av den.

Vi skulle också fullfölja första dagens laboration med att kontrollera renheten av plasmid.
Vi kontrollerade plasmids renhet från kromsomat DNA eller RNA m. h. a. elektrofores. I sjätte brunnen tillsattes plasmid preparation och det syns tydligt ett band som visar plasmiden.  Men den kan inte jämföras med markören som är linjära baspar med ccc-formad plasmid, eftersom linjära molekyler DNA vandrar långsammare än cirkulära supercoild plasmider.
Vi lyckades rena plasmiden från DNA/RNA molekyler. Om det skulle finnas förorening av kromosomalt DNA skulle DNA molekyler visas strax under brunnen VI och RNA molekyler nedanför plasmiden som smer men det visades ingen av dem.
Däremot eventuella open circle och linjär plasmid visas ovanför plasmid. De är samma plasmid som fick en nick brott(open circle) eller dubbel nick brott(linjär) i en fosfodiesterbindning.

Dag 1 Lab (ll37 gr4 Mihee)

Laborationer utförs i fyra dagar och första dagen av laborationen utfördes den 7 september 2011.

Första dagens laborations uppgifter är:

Att rena en rekombinat plasmid från en bakteriesuspension och att ta reda på renhet av plasmid DNA samt koncentration av DNA.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Troligtvis har föroreningar så som kromosomalt DNA, proteiner samt celldebris(cellrest) tagits bort från suspension.

Att ta reda på renhet av plasmid användes spektrometern genom aborbansmätning. Vid 260nm har nukleotider sitt absorbansmaxium och vid 280nm har proteiner sitt absorbansmaxium. Genom att beräkna kvot mellan absorbansvärdena (260nm/280nm =kvot) kan man veta renhet av plasmid. Kvot mindre än 1.8 är tecken på protein i plasmid.

Försök I:
Absorbans vid 260nm blev 0.044 och asorbans vid 280nm blev 0.013. Detta ger kvot ca 3.4 vilket är för högt. Koncentration av detta försök blev 16.9. Koncentration av DNA i plasmidlösningen kan räknas vid en absobans på 1.0  vid 260nm detta motsvarar 50μg DNA/ml.
Koncentration beräkning:
3.38 • 50μg/ml(=0,005μg/μl)=0.169
0.169•100(spädning) = 16.9 μg/μl

Eftersom vi fick för högt resultat gjordes ett andra försök för att se om det påverkades av blank.

Försök II:
Blank: 10μl EB buffert tillsätts blanken (10μl EB +990μl TE). Då absorbans vid 260nm blev 0. 068 och vid 280nm blev 0.037 vilket ger en kvot ca.1.84. koncentrationen beräknades 0.34μg/μl. (0.068•0.05μg/μl= 0.0034μg/μl → 0.0034μg/μl •100(spädning)= 0.34μg/μL
Det är ett bra resultat eftersom ren plasmid skulle vara mellan 1.8–2.0. Vilket tyder på att  kontamination av proteiner inte finns.Men vi vet inte om det finns rester av DNA och RNA eftersom de också har absoptionsmaxium vid 260nm.